"Zum herausragendsten Objekt der Sammlung Mittelalter gehört mit Sicherheit die Festung Marienberg selbst."

Frühe Glanzstücke der Sammlung sind die romanischen Bauplastiken, wie etwa die aufwendig verzierten Kapitelle der nicht mehr existierenden Kirche des Stift Haug in Würzburg aus dem 12. Jahrhundert.
Viele der mittelalterlichen kunsthandwerklichen Objekte bestechen durch ihre besondere Symbolik. In der Sammlung des Museum befindet sich ein außergewöhnliches silbernes Weihrauchfaß aus der 2. Hälfte des 15. Jahrhunderts von einem Nürnberger Meister. Dessen Oberteil erinnert durch die vielen Fenster und Bögen an Bauwerke und soll das Himmlische Jerusalem versinnbildlichen.
Stille Zeugen des kämpferischen Mittelalters sind die gotischen Rittergrabsteine, die den hohen Stand der hiesigen Skulptur des Mittelalters verdeutlichen. Doch auch das alltägliche Leben der Menschen in Franken wird in der Sammlung „Mittelalter“ des Museums für Franken repräsentiert: ganz deutlich wird dies an den seltenen Spielzeugfunden aus dem 13. und 14. Jahrhundert.
Eine Sammlung von internationalem Rang ist die Riemenschneider-Sammlung. Die ca. 100 Stücke aus Holz und Stein markieren eindrucksvoll den Wandel vom Mittelalter zur Frühen Neuzeit.